路徑分析的統計推論需要處理基因集之間的重疊、基因間的相關性、以及方向性資訊的整合。
ORA 的統計基礎
超幾何檢驗的虛無假設是：差異基因列表中屬於某路徑的基因數服從超幾何分布 X ~ Hypergeometric(N, K, n)，其中 N = 背景基因數，K = 路徑中的基因數，n = 差異基因數。p-value = P(X ≥ x)。此檢驗假設基因是獨立的，但實際上基因間存在表達相關性，導致 p-value 偏樂觀。
GSEA 的理論框架
GSEA 的 enrichment score 本質上是 weighted Kolmogorov-Smirnov-like statistic。原始實現中的基因集排列（gene set permutation）保持基因間的相關結構但可能在小樣本下 power 不足；表型排列（phenotype permutation）在有足夠重複時統計性質更好。fgsea（Korotkevich et al., 2021）使用解析近似極大地加速 p-value 計算。
Network-based 方法
將基因間的交互作用（PPI network、co-expression network）納入考量：
- SPIA（Signaling Pathway Impact Analysis）：結合 ORA 的統計顯著性和路徑拓撲資訊（上下游關係、活化/抑制）計算路徑 perturbation score
- EnrichmentMap（Merico et al., 2010）：以基因集之間的重疊程度建構網路，用 community detection 將冗餘的基因集聚類為 themes
- GSVA（Gene Set Variation Analysis）：為每個樣本計算每個基因集的 enrichment score，轉化為 pathway-level expression matrix，可用於後續的差異分析、survival analysis 等
方向性與因果性
傳統 ORA 和 GSEA 不區分基因的上調或下調。Causal reasoning approaches（如 IPA 的 Upstream Regulator Analysis）用路徑中的因果關係（A 活化 B、C 抑制 D）推斷上游調控因子的活化/抑制狀態。NicheNet 整合配體-受體對和下游信號路徑，推斷細胞通訊中的因果基因調控。
單細胞層級的路徑分析
在 scRNA-seq 中，傳統 GSEA 不直接適用（per-cell 數據太稀疏）。AUCell 計算每個細胞中基因集的 AUC score（排名中基因集成員的分佈）。decoupleR（Badia-i-Mompel et al., 2022）提供統一框架，用 multivariate linear model（MLM）或 weighted sum 方法估計每個細胞中 TF 活性或 pathway 活性。