DNA 連接反應的動力學和熱力學是選殖策略設計的量化基礎。
連接反應的動力學模型
連接反應涉及兩個競爭過程：分子內環化（intramolecular cyclization，希望的載體自環化和不希望的自環化都歸此類）和分子間連接（intermolecular ligation）。Dugaiczyk et al.（1975）定義了 j factor = 有效局部濃度（effective local concentration），描述線性分子兩端相遇的機率。對於短 DNA（<1 kb），j factor 隨長度增加而增加（因為 persistence length ~150 bp，短分子太硬不易彎曲成環）；>1 kb 後 j factor 與長度成反比（符合 random coil 模型）。
最佳的載體:插入片段莫爾比可以從 Jacobson-Stockmayer 理論推導：當插入片段的濃度 c_insert ≈ j(insert) / 2 時，線性重組產物相對於自環化的比例最大。實務上這對應到 ~1:3 到 1:5 的莫爾比。
ATP 依賴型 vs. NAD+ 依賴型連接酶
T4 DNA ligase（ATP-dependent）可以連接 blunt ends 和 cohesive ends。E. coli DNA ligase（NAD+-dependent）只能連接 cohesive ends 或 nick（不能連接 blunt ends），因此在一些應用中可以用來區分 nick ligation 和 de novo joining。Taq DNA ligase 在 45-65°C 活性最佳，配合 mismatch discrimination 用於 Ligase Chain Reaction（LCR）和 padlock probe circularization。
TA Cloning 的分子基礎
Taq polymerase 的 terminal transferase activity 在 PCR 產物的 3-prime 端添加非模板依賴的 adenine。pGEM-T 等 TA cloning vector 在線性化後的 3-prime 末端有互補的 T overhang。連接效率依賴 A-overhang 的完整性——過度延長的 PCR 反應或使用 proofreading polymerase（無 terminal transferase activity）會降低 A-overhang，需要額外的 Taq extension step。
Seamless cloning 的比較
Gibson Assembly、In-Fusion、SLIC（Sequence and Ligation Independent Cloning）和 SLiCE（Seamless Ligation Cloning Extract）都基於同源重組原理但實現方式不同。Gibson 使用 purified enzymes；SLiCE 使用 recombination-proficient E. coli 細胞提取物（更便宜但批次間變異大）。CPEC（Circular Polymerase Extension Cloning）利用 overlap extension PCR 原理，不需要 ligase。效率比較（Beyer et al., 2015）：Gibson > In-Fusion > SLIC for multi-fragment assembly。