Sanger et al.（1977, PNAS）的 chain termination 方法和 Maxam & Gilbert（1977, PNAS）的 chemical cleavage 方法同時開創了 DNA 定序時代（1980 年諾貝爾化學獎）。此後技術歷經三次革命，每次將成本降低 10⁴-10⁶ 倍。
Illumina SBS 的化學與光學
每個 cycle：四種 3'-blocked dNTPs（帶不同螢光）competitive incorporation → 全場成像（4-channel 或 2-channel chemistry）→ 光切割 fluorophore 和 3'-blocking group → 下一 cycle。NovaSeq X 使用 patterned flow cell（nanowells 定義 cluster 位置）提升密度至 ~25 billion clusters/flow cell。Base-calling 由 neural network（RTA/DRAGEN）執行。
PacBio HiFi 與 Nanopore 的技術比較
PacBio SMRT：Sequel IIe 的 ZMW（zero-mode waveguide, ~70 nm 孔）觀測單分子 polymerase 在 ~100 zL 體積中合成 DNA。CCS（circular consensus sequencing）= DNA 環化後聚合酶繞環多次讀取 → HiFi reads（>Q30, >10 kb）。應用：phased genome assembly、structural variant detection、full-length isoform sequencing。
Oxford Nanopore：motor protein（如 helicase）控制 DNA 穿孔速率，nanopore（CsgG 工程化變體 R10.4）的電流信號用 basecaller（Bonito, Dorado）解碼。R10.4 + Q20+ chemistry 達到 ~99% raw accuracy。Direct RNA sequencing 可同時讀取 RNA 序列和 RNA modifications（m⁶A, pseudouridine）。
基因組組裝的前沿
T2T（Telomere-to-Telomere）Consortium（Nurk et al., 2022, Science）利用 HiFi + ultra-long ONT reads 首次完成人類基因組的完整組裝（包含 centromeres 和 rDNA arrays），填補了 GRCh38 約 8% 的空白。Pangenome reference（Liao et al., 2023, Nature）整合 47 個多樣化基因組的 graph-based reference，取代線性參考基因組。
Spatial + Temporal Genomics
- Spatial transcriptomics（Visium, MERFISH, Stereo-seq）保留空間位置信息
- Single-cell multiome（10x Multiome, SHARE-seq）同時捕捉 ATAC + RNA
- Adaptive sampling（Nanopore）：即時選擇性定序——聚合酶讀取序列片段後，basecall 判斷是否為靶區域，不是則 eject → 即時富集目標序列而無需 PCR
文獻參考：Sanger, F. et al. (1977). PNAS, 74, 5463-5467. / Nurk, S. et al. (2022). Science, 376, 44-53. / Liao, W.W. et al. (2023). Nature, 617, 312-324.