層析法是蛋白質生化和結構生物學的核心技術，從實驗台（bench-scale）到工業規模的生物製藥純化都依賴層析平台。理解各類層析的熱力學和動力學原理、系統性純化策略的設計，以及層析與質譜（LC-MS）聯用的蛋白質體學（proteomics）應用，是現代生化研究者的必備素養。
層析理論基礎
分離效率以理論塔板數（N, theoretical plates）量化：N = 16(tR/W)²，其中 tR 為滯留時間、W 為峰寬。N 越大分離效率越高。塔板高度 H = L/N（L 為管柱長度），H 受 van Deemter 方程描述：H = A + B/u + C·u，其中 A = eddy diffusion（填充不均勻性），B = longitudinal diffusion（軸向擴散，低流速時主導），C = mass transfer resistance（質傳阻力，高流速時主導）。最佳流速（H 最小）在 B/u = C·u 時達到，即 u_opt = √(B/C)。
分離選擇性（selectivity α = k₂'/k₁'，k' 為容量因子）決定兩個峰能否分開。分離度 Rs = (√N/4)(α-1)/α · k'/(1+k')。Rs ≥ 1.5 為基線分離。
離子交換層析的定量考量
蛋白質與 IEX 樹脂的結合受靜電交互作用驅動，可用 Donnan 平衡和 Debye-Hückel 理論描述。實務上，結合強度與蛋白質的淨電荷（由 pH 和 pI 決定）和表面電荷分佈（charge patches）有關——兩個 pI 相同的蛋白質可能因表面電荷分佈不同而有不同的滯留行為。
線性梯度洗脫中的滯留因子與鹽濃度的關係：log k' = a - b·log[salt]，b 值（電荷參數）反映蛋白質與樹脂的靜電接觸面積。高解析度分離需要淺梯度（shallow gradient），但耗時長且稀釋樣品。
親和層析的分子設計
親和純化的效率取決於配體-蛋白質交互作用的 Kd（解離常數）。理想 Kd 範圍：10⁻⁴ - 10⁻⁸ M。Kd 太大（>10⁻³）→ 結合不穩定，樣品流穿；Kd 太小（<10⁻¹⁰）→ 難以溫和洗脫，可能導致蛋白質變性。
IMAC（immobilized metal affinity chromatography）的 His-tag 系統：Ni²⁺（或 Co²⁺）螯合在 NTA（nitrilotriacetic acid）上，His-tag 的 imidazole 側鏈配位金屬離子。洗脫用 imidazole 梯度（20-500 mM）競爭。非專一性結合的問題：內源性 His-rich 蛋白質共純化，需搭配 wash step（20-50 mM imidazole）去除。TEV protease 或 thrombin 可切除 tag 用於結構研究。
SEC 與蛋白質構象分析
SEC 在原生條件下進行，可區分單體、二聚體和更高階寡聚體。但 SEC 測量的是水力學半徑（Rh），不是分子量——非球形蛋白質（如纖維蛋白）或 intrinsically disordered proteins（IDPs）的表觀分子量會被高估。SEC-MALS（multi-angle light scattering）聯用可直接測量溶液中的絕對分子量，不依賴球形假設，是判斷蛋白質寡聚態的黃金標準。
LC-MS/MS 與蛋白質體學
Bottom-up proteomics：蛋白質先被胰蛋白酶（trypsin）消化為肽段，經 nanoLC（C18 反相管柱）分離後直接噴入質譜（ESI-MS/MS）。DDA（data-dependent acquisition）模式中，全掃描（MS1）選擇最強的前體離子進行碎裂（HCD/CID/ETD），產生 MS2 圖譜用於肽段鑑定（database search via Mascot/MaxQuant/Proteome Discoverer）。DIA（data-independent acquisition，如 SWATH-MS）模式對所有前體離子進行碎裂，結合 spectral library 進行定量，重現性更高。
定量蛋白質體學方法：label-free（LFQ, intensity-based）、metabolic labeling（SILAC）、chemical labeling（TMT/iTRAQ）。TMT（tandem mass tags）允許同時比較最多 18 個樣品，每個標籤在 MS1 等質量，在 MS2 碎裂後產生不同質量的 reporter ions 用於定量。