Gene Ontology 作為生物功能知識的形式化表示系統，其設計遵循 Open Biomedical Ontologies (OBO) 原則和 W3C 的 Web Ontology Language (OWL) 規範。
本體的形式化結構
GO 採用 OBO 的形式化框架：每個 term 有唯一 identifier（GO:XXXXXXX）、名稱、定義和跨本體的 cross-references。關係類型基於 RO（Relations Ontology）：is_a（子類型）、part_of（部分-整體）、has_part、regulates、positively_regulates、negatively_regulates。True Path Rule 規定：如果基因被注釋到某個 term，它也隱含被注釋到該 term 的所有祖先 terms。
注釋的品質層級
GO annotation 的品質與證據碼直接相關。IEA（Inferred from Electronic Annotation）佔所有注釋的 >98%，由自動化管線生成（如 InterPro2GO、UniProtKB keyword mappings），準確度約 90-95% 但偏向 well-studied 基因和功能。人工審核的 experimental evidence codes（EXP, IDA, IPI, IMP, IGI, IEP）品質最高但數量少（<2%）。在進行 GO enrichment analysis 時，可選擇性地只使用高品質注釋（但 sample size 會大幅減少）。
富集分析的統計改進
傳統 ORA 使用的 Fisher's exact test 假設基因獨立，但 GO 的 DAG 結構和基因間的相關性違反此假設：
- topGO（Alexa et al., 2006）：提供 elim 和 weight01 演算法，在 DAG 中由下而上消除子節點已解釋的基因，降低由 GO 結構造成的假陽性
- Gosemsim（Yu et al., 2010）：計算 GO terms 之間的語義相似度（information content-based: Resnik, Lin; graph-based: Wang method），用於基因功能相似度評估和冗餘 GO terms 的聚合
- REVIGO（Supek et al., 2011）：利用語義相似度矩陣將顯著 GO terms 聚類，並以 treemap 或散佈圖視覺化，解決結果列表過長的問題
GO-CAM（GO Causal Activity Models）
傳統 GO annotation 是基因到 term 的二元關聯，無法表達基因間的因果關係。GO-CAM（Thomas et al., 2019）引入結構化的 activity model，用 RDF triples 表達「gene A enables molecular function X, which is part of biological process Y, occurs in cellular component Z, and causally upstream of gene B's activity」。這為知識圖譜和自動推理提供了機器可讀的生物學知識表示。