原核-真核二元分類雖然實用，但分子演化學已揭示更複雜的圖像。古菌 (Archaea) 與真核生物的親緣關係比與細菌更近，導致 Woese 三域系統的建立。
Asgard 古菌與真核起源
2015 年 Lokiarchaeota 的發現改變了真核起源模型。Asgard 超門 (Loki-, Thor-, Odin-, Heimdall-archaeota) 帶有真核特徵蛋白 (ESP)：肌動蛋白同源物 (Lokiactin)、ESCRT 複合體組件、泛素修飾系統、小 GTPase。二域假說 (Eocyte hypothesis, Lake 1984) 主張真核生物源自古菌內，而非獨立的第三域。系統基因組學支持此觀點 (Spang et al. 2015, Nature)。
內共生的分子證據
內共生理論 (Margulis 1967) 的現代支持：粒線體基因組 (mtDNA) 動物 ~16 kb 環狀，植物 ~200-2000 kb；大多數粒線體蛋白由核基因編碼 (~1000-1500 個)，經 TOM/TIM 複合體轉運；氫化酶體 (hydrogenosome)、有絲體 (mitosome) 是退化粒線體。
內膜的演化起源
真核內膜系統可能源自質膜內陷 (invagination model) 或內共生物的 outer membrane 貢獻。核膜與 ER 腔連續性顯示內膜系統統一性。NPC (nuclear pore complex)：~120 MDa, ~500 蛋白 (30 種 nucleoporin)，選擇性通透。
CRISPR-Cas 與原核免疫
原核生物的「適應性免疫」：CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats；Cas9 等核酸酶用 RNA 引導切外源 DNA。已改造成基因編輯工具 (Doudna & Charpentier, Nobel 2020)。
定量差異
| 性狀 | 原核 | 真核 |
|---|---|---|
| 基因組大小 | 0.5-12 Mb | 10-100000 Mb |
| 基因數 | 500-10000 | 6000-50000 |
| 複製叉速度 | ~1000 bp/s | ~50 bp/s |
| 突變率 | 10^-6 to 10^-8 /bp/gen | 10^-9 to 10^-11 /bp/gen |
| 世代時間 | 20 min | 24 h (典型哺乳類) |
巨大病毒與第四域
Mimivirus, Pandoravirus (1+ μm) 挑戰「病毒非生物」觀點：基因組 > 某些細菌 (Mimivirus 1.2 Mb)、含轉譯相關基因。可能源自退化細胞 (reductive evolution) → 「第四域」假說。
開放問題：真核發生的精確時間線、內共生發生次數（一次 vs 多次）、LECA (Last Eukaryotic Common Ancestor) 的性狀全貌、原核多細胞性為何罕見。