現代細菌分類學已從純表型分類轉型為整合基因體學的「多相分類法」（polyphasic taxonomy），結合表型、化學分類標記和全基因體資訊。
分子系統發育方法論
16S rRNA 基因分析的侷限包括：(1) 某些近緣種 16S 序列幾乎相同（如 Bacillus anthracis 和 B. cereus 差異 <1%）；(2) 側向基因轉移（LGT）導致單基因樹無法反映真實物種演化史；(3) 16S 拷貝數和序列在基因體內可能不一致（intragenomic heterogeneity）。
全基因體時代的分類指標：
- ANI（Average Nucleotide Identity）：用 BLAST 或 MUMmer 計算兩個基因體間同源區段的平均核苷酸一致性。95-96% 的物種界限與 DNA-DNA 雜交 70% 的傳統金標準高度吻合（Goris et al., 2007）。
- dDDH（digital DNA-DNA hybridization）：GGDC 工具在矽中模擬實驗室 DDH，70% dDDH 對應 ANI ~95%。
- 核心基因系統發育（Core genome phylogeny）：提取數百個單拷貝直系同源基因，串聯比對後建樹，較單基因方法更穩健。
- AAI（Average Amino acid Identity）：適合較遠親緣的比較（屬和科級別）。
微生物體學與無培養分類
16S 擴增子定序（amplicon sequencing）和宏基因體學（metagenomics）揭示了「微生物暗物質」——超過 99% 的環境微生物無法用傳統方法培養。擴增子方法用 OTU（97% 聚類）或 ASV（amplicon sequence variant，單核苷酸解析度）作為操作分類單位。
基因體重組自宏基因體組裝（MAG, Metagenome-Assembled Genome）正在顛覆分類系統。GTDB（Genome Taxonomy Database, Parks et al., 2018）基於 ~30,000 個基因體建立全新分類框架，用 RED（relative evolutionary divergence）值標準化各分類階層的演化距離，導致許多傳統分類被重新調整。例如，傳統的 Firmicutes 門被拆分為多個門。
化學分類標記
- 脂肪酸甲酯分析（FAME）：細菌膜脂肪酸組成是屬/種級別穩定的表型標記。
- 極性脂類圖譜（polar lipid profiles）：對古菌和放線菌分類尤其有用。
- 肽聚醣化學型（peptidoglycan chemotype）：交聯方式（A 型直接交聯 vs B 型通過橋接氨基酸）在 G+ 菌分類中有診斷價值。
- MALDI-TOF MS：分析核糖體蛋白質譜（2-20 kDa），與資料庫比對實現快速鑑定。在臨床實驗室已大幅取代傳統生化鑑定。
物種概念的哲學挑戰
細菌缺乏有性生殖，無法套用「生物學物種概念」（BSC）。加上水平基因轉移頻繁，細菌基因體是鑲嵌式的，部分學者（Doolittle, 2009）甚至質疑「細菌物種」是否真正存在。目前操作性定義基於基因體相似度閾值（ANI 95-96%），但這仍是人為劃界，自然界的物種邊界是連續的基因流梯度。