色層分析（chromatography）由 Mikhail Tsvet（1903）以紙管分離葉綠素首創，得名 chromatography（colour-writing）。植物色素層析作為教學原型展示分配色層分析的核心概念，工業上已演化為 HPLC、UPLC、GC、IC 等高效分離平台。
分配色層分析的熱力學基礎
樣品分子在兩相間建立分配平衡：K = C_s / C_m（fixed phase 與 mobile phase 之間的濃度比）。在紙層析中，固定相是 cellulose 纖維結合的水，移動相是有機溶劑。分子的分配係數差異導致不同 retention factor：
Rf = 1 / (1 + K · V_s/V_m)
其中 V_s/V_m 是相體積比。實際 Rf 受溫度、濕度、樣品量、紙均勻性等多因素影響。
葉綠體色素的精細結構
- 葉綠素 a/b：4 個 pyrrole 環構成 chlorin 核（部分還原的 porphyrin）+ Mg²⁺ 中心 + phytol 長尾。a 的 C7 為 -CH₃，b 為 -CHO，這個小差異造成吸收光譜紅移與 antenna 角色差異。phytol 尾錨定於 thylakoid 膜。
- β-carotene：40 碳全 trans 多烯烴，11 個共軛雙鍵，吸收 400-500 nm 藍光，激發態經 ISC 進入 triplet state 可淬滅 chlorophyll triplet 或 ¹O₂（光保護）
- Xanthophylls：α-、β-carotene 衍生物加氧（hydroxyl、epoxy、keto），lutein、zeaxanthin、violaxanthin、neoxanthin 等。Violaxanthin cycle（violaxanthin ↔ antheraxanthin ↔ zeaxanthin）在強光下熱耗散過剩能量（NPQ, non-photochemical quenching）
- Pheophytin：缺 Mg 的 chlorophyll，PSII 反應中心初級電子受體
- Phycobilins（藍藻、紅藻）：開鏈四吡咯，covalent attached to phycobilisome 蛋白
HPLC 與 UPLC 分離
反相 HPLC（C18 column + acetonitrile/methanol/水 gradient）是現代 standard。檢測：DAD（diode array detector）多波長同時、MS（質譜偵測，識別未知色素）、ICP-MS（重金屬如 Mg 含量）。內標物（β-apo-8'-carotenal）校正回收率。樣品前處理：冷凍乾燥、皂化（saponification 去 lipids）、ultrasonic 萃取增效。
TLC 進階應用
二維 TLC（2D-TLC）：第一向用低極性溶劑分離 carotenoids，旋轉 90°用高極性溶劑分離 chlorophylls 和 xanthophylls。可分離 30+ 色素。densitometry 量化（CAMAG TLC scanner）。
色素生合成路徑
Chlorophyll：glutamate → ALA（aminolevulinic acid）→ porphobilinogen → uroporphyrinogen III → protoporphyrin IX → Mg-protoporphyrin → protochlorophyllide → chlorophyllide a → chlorophyll a → chlorophyll b（CAO 氧化酶）。Carotenoids：MEP pathway → GGPP → phytoene（PSY）→ lycopene → α/β-carotene 分支 → xanthophylls。
生態與生物技術應用
- 食品工業：β-carotene、lutein 作為天然色素與維生素 A 前驅物
- Golden Rice：β-carotene 強化米作對抗 VAD（vitamin A deficiency）
- 微藻生物科技：Haematococcus pluvialis 生產 astaxanthin（抗氧化保健食品）
- 古生態學：trapped pigments 重建古海洋生產力
- 視覺色彩科學：人類視網膜含 lutein/zeaxanthin 黃斑色素
新興技術
超臨界流體層析（SFC）：CO₂ 為移動相，環保、快速、選擇性可調。Ion mobility-mass spectrometry：增加分離維度，區分同分異構物 carotenoid epimers。Native lipidomics：保留色素-蛋白複合體結構，研究體內天然色素分布。