「基因」的定義在分子生物學的發展歷程中經歷了多次重大修訂。從 Johannsen（1909）提出基因為遺傳的抽象單位，到 Beadle & Tatum（1941）的「一個基因一個酶」假說，再到 Benzer（1957）用 rII 系統將基因細分為 cistron、recon 和 muton 三個功能層次。ENCODE 計畫（2012）的資料顯示，約 80% 的人類基因體至少有某種生化活性（轉錄、轉錄因子結合或染色質修飾），雖然這些活性是否具有功能性仍有爭議（Graur et al., 2013 批評 ENCODE 混淆「生化活性」與「功能」）。
真核基因的精細結構
啟動子架構：哺乳動物啟動子可分為 TATA 依賴型（約 10-20% 基因）和 CpG 島依賴型（約 70% 基因）。CpG 島是長度 >200 bp、GC 含量 >50%、觀察/預期 CpG 比 >0.6 的區域。CpG 島啟動子通常缺乏 TATA box，有多個分散的轉錄起始位點（broad promoter），與管家基因（housekeeping genes）相關。TATA 依賴型啟動子通常有精確的轉錄起始位點（focused promoter），與組織特異性表現相關。
內含子的演化意義與功能：Gilbert（1978）的「外顯子混搭」（exon shuffling）假說認為內含子促進了蛋白質結構域（domain）的重組，加速蛋白質演化。支持證據包括許多外顯子邊界與蛋白質結構域邊界一致。然而，內含子也有直接功能：
- 第一個內含子常含有增強子元件，對基因表現有重要調控作用
- snoRNA（小核仁 RNA）和 miRNA 常嵌入在宿主基因的內含子中
- 內含子的存在提升 mRNA 輸出和轉譯效率（intron-mediated enhancement, IME）
選擇性剪接的機制與調控
選擇性剪接由富含絲氨酸-精氨酸的 SR 蛋白（促進剪接）和 hnRNP 蛋白（通常抑制剪接）的拮抗作用調控。剪接調控元件包括外顯子剪接增強子（ESE）、外顯子剪接沉默子（ESS）、內含子剪接增強子（ISE）和內含子剪接沉默子（ISS）。
Wang et al.（2008）的 RNA-seq 分析顯示人類基因約 95% 有選擇性剪接，主要形式包括：外顯子跳過（exon skipping, ~40%）、替代 5' 或 3' 剪接位點（~25%）、內含子保留（intron retention, ~10%）和互斥外顯子（mutually exclusive exons）。DSCAM 基因在果蠅中可產生 38,016 種 mRNA 異構物（isoforms），超過果蠅基因總數的兩倍。
剪接異常（splicing defects）估計導致 15-50% 的遺傳疾病。深層內含子突變可能創建新的剪接位點或破壞調控元件，這些在傳統外顯子定序（WES）中容易被遺漏，是 WGS 相對於 WES 的重要優勢之一。
非編碼 RNA 基因
現代基因定義必須涵蓋非編碼 RNA（ncRNA）基因：
- rRNA 和 tRNA：轉譯機器的核心組件
- miRNA（~22 nt）：由 Drosha 和 Dicer 加工，透過 RISC 複合體抑制靶標 mRNA
- lncRNA（>200 nt）：如 XIST、HOTAIR、MALAT1，功能多樣——染色質重塑、轉錄調控、mRNA 穩定性
- circRNA：環形 RNA，由 back-splicing 產生，可作為 miRNA 海綿
基因體架構與三維組織
基因不是孤立存在於線性 DNA 上。染色質的三維結構（Hi-C 技術揭示的 TADs — topologically associating domains）將基因組織成調控區域。TAD 邊界由 CTCF 和 cohesin 維持，邊界的破壞可導致增強子「入侵」鄰近 TAD、異常活化或抑制基因（enhancer hijacking），這是某些先天異常和癌症的致病機制。
表觀遺傳修飾對基因結構的功能影響
基因結構的「功能狀態」受表觀遺傳修飾調控：H3K4me3 標記活化啟動子、H3K27me3 標記沉默啟動子、H3K36me3 標記被轉錄的基因體、H3K4me1+H3K27ac 標記活化增強子。ChromHMM 等工具根據組蛋白修飾組合將基因體標註為不同的功能狀態（active promoter, poised enhancer, heterochromatin 等）。